模型及戒断后对成年大鼠神经干细胞增殖的影响，为以后NSC应用于治疗临床相关疾病提供基础实验资料。 参考文献： 1.Masaru Tateno, MD, PhD, Toshikazu Saito, MD, PhD. Biological Studies on Alcohol-Induced Neuronal Damage, Psychiatry Invest 2008；5:21-27. 2.Yazan Alderazi, Francesca Brett. Alcohol and the nervous system . Current Diagnostic pathology 2007；13:203-209. 3.Cliver Harper and Izuru Matsumoto. Ethanol and brain damage .Current Opinion in Pharmacology 2005；5:73-78 . 4.Fulton T. Crews, Ph. D, et al,.Alcohol, neural stem cell, and adult neurogenesis, Alcohol Res Health 2003；27(2):197-204 . 5.G.F. Hamilton, N.J. Murawski, et al. Neonatal alcohol exposure disrupts hippocampal neurogenesis and contextual fear conditioning in adult rats. Brain Res 2011;88-101. 6.Kimberly Nixon , Alcohol and Adult Neurogenesis: Roles in Neurodegeneration and Recovery in Chronic Alcoholism, Hippocampus 2006 ;16(3):287-95. 7.Michael A. Taffe, Roxanne W.et al.Long-lasting reduction in hippocampal -neurogenesis by alcohol consumption in adolescent nonhuman primates. Proc Natl Acad Sci U S A 2010 ;107(24):11104-9. 8.F. T. Crews, Michael W. Miller, et al .Neural Stem Cells and Alcohol, Alcohol Clin Exp Res 2003 ;27(2):324-35 . 二、研究内容、研究方案及技术路线： 1．动物：健康雄性、8-10周龄Sprague-Dawly大鼠30只，体质量200±20g。 2．仪器设备、手术器械：注射器，手术剪，钳夹，咬骨钳，眼科剪，大小镊子等。 3．试剂：无水乙醇，乐百氏纯净水，抗 nestin，抗GFAP-δ， 1%Tritond试剂， PBS，双氧水试剂，二甲苯，动物自动饮水器，图象分析仪（Olympus），松下DV机、冰冻切片机等。 4．实验方法： （1）实验分组及酒精成瘾模型制备。动物适应7天后再进行实验，水和食物自由获得。将30只大鼠随机分为3组，分别为对照组A组8只，慢性酒精暴露组B组11只，酒精戒断组C组11只，在光线，温度，适度可控制下均单笼饲养。每天上午8:00更换新配制酒精并测量剩余酒精量，B和C组大鼠连续自由饮含低浓度乙醇（6%）的水溶液28天，建立酒精依赖模型（没有酒精成瘾的大鼠舍去），对照组继续饮用纯净水，任意进食。适应阶段，按酒精浓度从低到高，经过7天达到设计酒精浓度（第1d水，第2-3d 1.5% ,第4-5d 3.0% ,第6-7d 4.5% ,以后维持在6%的水平。 （2）制备海马组织失状切片。对照组和酒精依赖组在28天后，使用水合氯醛麻醉大鼠后，开胸后经左心室插管，先以100 mL生理盐水冲洗血管，随后用冷的(4℃)含4％ 多聚甲醛的0.1 mol／L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)250 mL灌流，固定后打开颅骨钝性分离完整取脑，分离海马。海马组织置于20%蔗糖溶液中保存3天至沉入瓶底，再移入30%蔗糖溶液中4℃冰箱保存备用。 应用冰冻切片机取各组大鼠右侧大脑海马做矢状切片，每张切片厚度为10μm，将脑片置-20℃冰箱保存。分别取大鼠脑内海马组织做免疫组织化学分析。 酒精戒断组在28天后，撤除6%酒精水溶液，改为正常饮水3天，分别断头取大脑内的海马组织，做免疫组织化学分析。 （3）免疫组化分析。取出冰冻切片经复活后，先用Triton试剂处理5分钟，再用H2O2，以去除过氧化氢酶的活性，加入山羊血清封闭液，用PBS冲洗干净后，每组切片针对神经干细胞标志物nestin和GFAP-δ做免疫组化分析，加入抗nestin和抗GFAP-δ，放入4℃冰箱过夜。于第二天加入二抗， |
